蓝莓(blueberry)属于杜鹃花科越橘属植物，多年生落叶或常绿灌木。蓝莓果实含有众多功能活性物质，其营养价值日益受到人们的广泛认可。目前我国蓝莓的种植面积逐年增大，2005年已达到667 hm22]，而丰富的蓝莓叶资源并未得到良好利用。一般当作废弃物直接丢弃，这既造成资源浪费又带来环境污染。研究表明，蓝莓叶中含有丰富的黄酮、原花青素、花色苷等多酚类生理活性成分，还富含多种微量元素。目前国内外对植物提取物的研究已有不少，对蓝莓叶的研究主要集中在活性物质的提取纯化、稳定性分析及其生理功能表征等方面，而对不同提取方法和成熟度对蓝莓叶生物活性的影响研究较少。

    本研究对不同品种，不同成熟度和不同提取方法所得的蓝莓叶提取物的生物活性进行了对比研究，测定了蓝莓叶提取物中的总酚含量、清除自由基(DPPH)能力和还原力大小，以求对蓝莓叶生物活性有一个概括研究，为深化蓝莓叶的开发利用提供有益的实验依据。

1  材料与方法

1.1  材料、试剂与仪器

1.1.1  材料

    蓝莓叶子于2012年5月和6月采自上海市青浦区现代农业园区。采摘后立即送往上海交通大学农业与生物学院，将茎叶分离，洗净，晾干。用真空冷冻干燥机将鲜叶干燥后用组织捣碎机捣碎，存放在--80℃冰箱中，备用。

1.1.2  试剂

    无水乙醇、甲醇、氢氧化钠、盐酸、无水碳酸钠、福林酚、没食子酸、抗坏血酸、铁氰化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三氯乙酸、氯化铁国药集团化学试剂有限公司；1，1---苯基一2-三硝基苯肼( DPPH)梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。

1.1.3仪器

    冷冻干燥机（Triad，美国Labconco公司）、水浴锅（2875，美国赛默飞世尔科技公司）、恒温振荡器（420，美国赛默飞世尔科技公司）、旋转蒸发仪(RE-52AA，巩义市予华仪器有限公司)、离心机(Z236K，德国Hermle公司)、UV-1800紫外分光光度计（Shimadzu，日本岛津国际贸易（上海）有限公司）等。

1.2  方法

1.2.1  蓝莓叶提取

    (1) 50%乙醇提取：准确称取2 9样品，加入24 mL 50%的乙醇，混匀。在室温下避光振荡30 min，收集提取溶液，随后以转速12 400 r/min离心10 min。上清液先用滤纸后用0.2 μ

    (2) 95%乙醇提取：准确称称取5 9干燥样品，用95%的乙醇在50℃下振荡提取2次，每次用量约为33.33 mL，时间30 min。离心并将上清液合并，40℃旋转蒸发浓缩后，将提取液转移至50 mL的容量瓶中，用70%的乙醇溶液定容。保存于--80℃条件，备用。

    (3)酸碱提取：准确称取5 9干燥样品，加入20 mL 2 mol/L HC1，在沸水浴1.5h。冷却后，加入20 mL 2 mol/L NaOH，用70%的甲醇定容至100 mL。混合液在室温中放置40 min，随后在1 9000 r/min下离心5min。上清液保存于--80℃条件，备用。

1.2.2  总酚的测定。

    采用福林酚方法测定。取200 μL-定浓度的提取物，加入1 mL的福林酚试剂，充分混匀后加入0.8mL的20%的Na2 C03溶液，充分混匀，在40℃水浴中反应20 min，在765 nm的波长下测吸光度。结果以没食子酸含量表示。

1.2.3  抗氧化性的测定

    (1)清除自由基能力( DPPH)的测定：取0. 75 mL适当浓度的蓝莓提取液与1.5 mL的0.09 mg/mL DPPH甲醇溶液漩涡振荡混匀。在室温下避光放置5 min，在517 nm条件下测定吸光度。以抗坏血酸做标曲，并计算抗氧化物含量。

    (2)总抗氧化能力的测定：方法参照Kuda等方法。将1.0 mL的提取物溶液与2.5 mL的磷酸盐缓冲溶液(50 mmol/L，pH7.0)和2.5 mL的铁氰化钾(1%)溶液充分混合，在50℃下反应20 min。反应后加入2.5 mL的三氯乙酸(10%)并离心(3 000 r/min) 10 min。取1.25 mL的上清液加入1.25 mL的蒸馏水和0.25 mL的氯化铁(0.1%)溶液混匀。在700 nm的波长下测其吸光度，吸光值越高，表示试样还原能力越强。对照试验加入 BHT和单宁酸。

2  结果与分析

2.1  不同品种蓝莓叶提取物的总酚含量

    没食子酸标准曲线。回归方程为y一13.413α+0.106 6，R2:0.996 0，其中y为实验所得的吸光值，z为样品浓度(mg/mL)。结果表明，没食子酸浓度在0～0.06 mg/mL范围内具有良好的线性关系。

    同一成熟度、品种，不同提取方法的蓝莓叶中的总酚含量具有显著性差异，不同提取方法中的总酚含量从大到小依次为方法1（50%乙醇振荡提取）>方法2（95%的乙醇振荡提取）>方法3（酸碱提取）。例如6月V3品种由方法1提取的总酚含量分别约是方法2、方法3的1.3和4.4倍。这种差异是由提取溶剂的不同而造成的，50%的乙醇可以将叶中的酚类物质（包括水溶性和醇溶性酚类）更好地提取出来。程安玮等人ElS]研究表明，萃取溶剂对蓝莓叶中多酚的提取率具有明显的影响作用，且蓝莓叶中可萃取多酚和不可萃取多酚的含量基本相同。对于同一种提取方法和同一成熟度，5月份采摘的蓝莓叶，不同品种之间总酚含量差异较小，但到6月份不同品种之间蓝莓叶提取物的总酚含量差异较大，其中在提取方法1、方法2中 V5较V3分别增加了39%和1 9%，而方法3却降低了58%。同一品种和提取方法，不同成熟度的蓝莓叶提取物中总酚含量有显著性差异。Olaniyi Amos Fawole等人研究表明，石榴在成熟过程中其总酚的含量和抗氧化能力均有明显降低。由此，我们推测上述结果主要因为不同蓝莓品种中的总酚有差异，且在不同成熟度下总酚含量会有变化。

2.2  不同品种蓝莓叶提取物的清除自由基能力的分析

    以抗坏血酸为标品所做标准曲线如图2所示。回归方程为y=--51.06+1.064 6．R2:0. 991 9，其中y为实验所得的吸光值，x1为样品浓度( rag/ ml．)。结果表明，抗坏血酸浓度在0～0.02 mg/mL范围内具有良好的线性关系。

    不同熟度、品种及提取方法的蓝莓叶中的清除自由基能力规律与总酚规律基本一致。总体来说，提取方法1比方法2和方法3所得提取物的清除自由基能力高1 5%和31%以上，这种差异

在6月V5品种中达最大，最高分别是38%和132%。而方法2和方法3所得提取物的清除自由基能力基本没有显著差异。刘曦等人E20l研究表明，不同溶剂提取物抗氧化能力差别较大，其抗氧化活性随提取溶剂的极性的减小而减小。

2.3蓝莓叶提取物的总还原力的分析

    总还原力在不同的提取方法中均有显著性差异，经方法3提取的蓝莓叶的总还原力最小，在0.15以下；经方法1提取的蓝莓叶的总还原力最大，接近0.5。经方法1和方法2提取的蓝莓叶中，品种V3的总还原力较V5高S%o以上。在方法3的蓝莓叶提取物中，品种V5的还原力较V3强，约为V3的1.1倍。B图中，经方法1、方法2提取的蓝莓叶中V5的还原力较V3强，均高25%以上。经方法3处理后，所得提取物的还原力在2个品种间没有差异。这可能是由于不同方法提取到的物质有所不同，且不同成熟度的蓝莓叶中所含的具有还原力物质的种类和含量有较大差异，从而导致其还原力的不同。

3  结论与展望

    研究表明，蓝莓叶较多叶绿色蔬菜含有较为丰富的总酚，并有较强的清除自由基能力和还原力。在不同的提取方法中，50%乙醇溶剂提取的蓝莓叶生物活性较其他方法提取的强一些；不同品种V3和V5的蓝莓叶在同一成熟度和同一提取方法，其生物活性差异较小，但不同成熟度的蓝莓叶的生物活性有较大差异。本研究既可促进蓝莓叶的合理利用，使之变废为宝，又为抗氧化产品研发提供了新的资源，为蓝莓叶的深化开发利用提供了可靠的实验依据。

杨贵云，钱炳俊，岳  进，钟  宇，王丹风，赵艳云，邓  云（上海交通大学农业与生物学院）