自从200多年前，Jenner's发明牛痘疫苗以来，全世界已经制备了大量的人和动物疫苗，重组亚单位疫苗避免了传统疫苗具有的危险，在动物传染病的防

治中越来越重要。制备亚单位疫苗的首要步骤就是找到能诱导机体发生保护性免疫反应的抗原。众所周知，转基因植物可以用来表达这种保护性抗原，即转抗原基因植物疫苗，它大大降低了疫苗的制备和免疫成本。

    许多研究都致力于证明植物疫苗(plant-made vaccine，PMV)口服的可行性。口服给药由于操作简单，能诱导感染部位局部黏膜免疫反应而备受关注。良好的口服疫苗在胃酸环境中能稳定存在，能刺激黏膜免疫反应，从而保护机体抵抗疾病的感染。小肠上皮细胞具有双重功能，从而使黏膜免疫系统能识别有害的病原体抗原和无害的食物抗原。进入机体的抗原，可以被M细胞通过胞吞方式，也可以被肠上皮细胞通过受体介导的方式摄取和转运，被抗原递呈细胞(APC)捕获后而启动黏膜免疫反应。此外，树突状细胞(DC)可以直接从肠腔中捕获高分子物质和颗粒性抗原。

人类临床试验初步表明转基因植物材料经加工后可以作为口服疫苗。目前世界制定了各种相关临床医疗法案用以规范植物疫苗健康发展，现在人用转基因药物(plant-made pharmaceutical，PMP)更倾向于纯化产品。动物药物比人用药物有关限制要低，且经许多动物试验证明是有效的，因此用转基因植物制备兽用口服疫苗前景诱人。兽用PMP已经有过详尽的阐述。本次报道就转抗原基因植物疫苗的开发及其在控制动物传染病方面的应用作一综述。

1疫苗抗原在植物中的表达

1．1转抗原基因植物受体的选择

    模式植物烟草，经常用来表达重组蛋白。因为它的再生和转基因技术已经非常成熟，在试验室中就可以生长和开花结籽，转基因叶片在开花之前就可以获得，极大地降低了花粉传播导致基因渗漏到环境或食物链的风险，因此被认为是开发生物制剂的平台和开发转基因植物疫苗的常用受体。但烟草中尼古丁类的生物碱限制了它的应用。

豆科植物苜蓿和白三叶广泛种植，蛋白含量高，具有固氮作用，降低生产成本的同时能改善环境。莴苣和菠菜可以被食用，所以也是人用口服疫苗潜在的传递工具。水果和蔬菜能够生食，也可以用来制备疫苗，如香蕉、番茄、樱桃、马铃薯、甜瓜、胡萝卜。豆科类中的木豆、大豆、花生，都曾经用来作为抗原疫苗表达的受体。玉米、水稻和大麦等农作物也可以用来制备转抗原基因植物疫苗。

1．2植物疫苗的表达系统

植物表达免疫原性多肽，有3种方式。第1种将目的抗原的编码基因插入植物组织核基因组或细胞器基因组中，从而植物可以在特异部位稳定表达抗原。稳定的表达系统可以通过农杆菌介导或高流速的金或钨等微弹轰击遗传转化方法及随后的组织培养技术而获得。拟南介和其他一些植物也可以通过农杆菌浸花法和真空渗透法进行转化，这种方法可以省去冗杂的组织培养过程。第2种将编码抗原蛋白或多肽的基因插入到植物病毒中，然后感染植物，从而启动瞬时表达。抗原既可以和病毒外壳蛋白融合表达从而在病毒粒子表面呈现，又可以以不融合的重组蛋白形式在植物中表达。第3种方式是农杆菌工程菌渗透法的瞬时表达系统。

1．2．1  转基因植物稳定表达系统

    稳定的转基因植物表达系统优于瞬时表达系统，主要在于(1)抗原蛋白的表达能稳定传递给子代，比较容易地获得大量转基因株系；(2)药物蛋白纯化所需的费用往往占生产成本的一半之多，转基因植物表达的抗原可不经纯化直接口服免疫，大大降低了生产成本；(3)可以同时将多个外源基因与植物基因重组，从而获得多基因复合疫苗产品。

稳定表达系统的缺点是植株的再生和纯合所需时间长，建立有效的植物转化体系可能要花费几个月的时间；蛋白表达和积累不可预测；部分植物对这种转化方法不敏感；抗原蛋白表达含量低。但是目前随着质体转化技术的不断完善，可以使抗原蛋白在植物体内高水平的积累。

1．2．2病毒载体介导的瞬时表达系统

植物病毒表达系统的抗原表达水平比稳定表达系统高。应用植物病毒表达系统获得抗原蛋白需要对呈现外源多肽的重组病毒或游离的外源蛋白进行纯化。要想病毒粒子正常装配，插入到病毒基因组中外源基因片段大小受到严格限制。与转基因植物表达系统相比(尤其是种子，块茎和果实)，病毒感染的叶片更不容易储存，但是植物病毒颗粒纯化后在合适条件下可以储存较长的时间。植物病毒表达系统大大节约了时间和劳动力，可以验证各种病毒载体的可行性并能在几个星期内放大，这为开发针对对新出现的病原体的植物疫苗是非常必要的。在植物病毒表达系统中，重组病毒粒子必须接种到植物体中才能繁殖，因此抗原蛋白不能大规模生产，遗传稳定性需多次继代后才能确定。表达抗原蛋白的病毒能感染田间植物，遗传改造的病毒扩散到环境中的几率非常高，所以这种转化系统必须被限制在某个特定的环境如温室中。

1．2．3农杆菌渗透法介导的瞬时表达系统

农杆菌渗透法简便易行，可以对重组蛋白的表达载体的遗传构建作初步快速评估，因此逐步成为外源蛋白表达的平台。德国公司Icon Genetic将高效转化的农杆菌渗透法和高效表达的病毒载体转化法相结合，建立了Magnifection技术体系，在快速大规模制备抗原和抗体中表现了无可比拟的优越性。与病毒载体介导的瞬时表达系统类似，农杆菌渗透转化系统也不能克服基因渗漏和重组蛋白需要纯化等缺点。

2转基因植物疫苗在动物传染病防治中的作用

目前用于动物传染病防治的转基因植物疫苗主要针对病毒病原体，并不是由于缺少细菌病原体而是由于缺少有效的低成本的控制动物病毒感染的方法，细菌感染可以通过抗生素来控制。但是目前或即将出台的有关抗生素在非治疗性方面使用的禁令将会推动新方法的产生以促进畜牧业健康发展。尽管植物抗原疫苗还处在实验动物的测试阶段，但口服给药后却在保护动物免受疾病感染中表现出很多优点。有些情况下，用于动物疾病防治的植物抗原疫苗也可以用来推动人类健康的发展。

2．1  植物抗原疫苗在鸡疫病防治中的应用

我国的一个研究小组成功制备了转基因马铃薯抗支气管炎病毒(IBV)疫苗。表达S糖蛋白的马铃薯切成片后每隔7 d口服灌喂14日龄小鸡，给药3次后1周IBV攻毒，结果表明口服免疫的小鸡能产生病毒特异抗体，且能对IBV的攻击起保护作用；Wu等人在研究防治鸡传染性法氏囊病植物抗原疫苗方面取得了成功。用转基因拟南介蛋白粗提物口服免疫雏鸡，与注射商业化疫苗诱导的保护力相当。

2．2植物抗原疫苗在牛疫病防治中的应用

    据报道转牛痘病毒凝集素花生可以增强牛的免疫力，5～5．7 g转基因叶片口服给药3次后，可以诱导机体产生特异抗体。2003年，Perez等人将牛疱疹病毒糖蛋白D与TMV病毒载体重组后接种到烟草中，植物粗提物与食用油乳化后注射到牛体中，能刺激机体的体液和细胞免疫反应，最重要的是产生的保护力与商业疫苗类似。

巴斯德肺炎，也叫牛运输热，是由溶血性曼氏杆菌引起的。白细胞毒素的一个片段与GFP融合后对苜蓿和白三叶进行遗传转化。转基因植物对兔子进行肌肉注射并对融合蛋白的免疫原性进行评价，发现产生的抗体在体外可以与白细胞毒素发生中和反应。

2．3植物抗原疫苗在猪疾病防治中的应用

    许多研究小组致力于开发转传染性肠胃炎病毒(TGEV)植物疫苗。病毒刺突蛋白中和抗原分别在转基因烟草、拟南介、马铃薯块茎和玉米种子中得到表达。转基因植物口服或注射免疫老鼠均具有免疫原性。2000年，Tuboly等人将转基因烟草蛋白粗提物肌肉注射免疫仔猪后，能检测到病毒特异性抗体。此外，研究者还发现中和抗原在各种条件下都能稳定存在。

    Bae研究小组主要研究防治猪流行性腹泻(PEDV)的转抗原基因植物疫苗。他们将编码PEDV的中和性表位基因整合到烟草中，同时发现烟草提取蛋白口服免疫老鼠能产生病毒特异抗体。

产肠毒素大肠杆菌(ETEC)F4菌毛仅在猪源ETEC中表达，其主要亚单位已经在烟草、苜蓿和大麦中表达。F4亚单位疫苗具有免疫原性，口服免疫仔猪后具有免疫保护作用。除了用黏附因子开发疫苗外，许多研究将目光转移到ETEC热稳定肠毒素B亚单位(LTB)上。LTB介导毒素与肠上皮细胞的结合，LTB在植物中表达时，可以进行自组装配，且转基因植物能保护老鼠抵抗LT肠毒素的攻击。

3提高抗原在植物中表达水平的策略

转抗原基因植物疫苗口服免疫动物，抗原必须充足。然而植物中外源蛋白表达比较低，限制了转抗原基因植物疫苗的广泛使用。提高抗原表达水平与优化口服剂量、减少疫苗抗原纯化成本同样重要。植物的生物总量和内源蛋白含量决定它的疫苗传递能力。但是多种因素影响抗原在植物中表达。为得到高表达量的疫苗，基因表达的各个环节，从转录到蛋白稳定性，都必须合理设计。

3．1转录和mRNA的稳定性

启动子调控基因的转录，是表达载体中最重要元件。现已发现有许多启动子能增强外源基因在植物中的表达。组成型花椰菜花叶病毒35 s启动子在双子叶中广泛使用，能组成性诱导基因表达。单子叶转基因植物一般多使用玉米的Ubiquitin启动子。基因转录后要防止转录产物被降解，并能保证其有效地转移到胞质中进行翻译。转录后的加工过程如5端加帽、mRNA前体剪接及3端polya都会影响基因在植物细胞中的表达。polya信号强烈影响mRNA稳定性及植物细胞中基因的表达水平。Richter等人在马铃薯中对3种不同的polya信号作了比较，发现vsp和马铃薯蛋白酶抑制剂2(pin2)的Polya信号更能促进乙肝病毒表面抗原(HBsAg)在植物中的积累，表达水平比nos终止子提高了几倍。

3．2翻译

植物多肽合成中mRNA翻译的引发是随机的，优化引发位点和Kozak序列可以增强翻译的启动。翻译启动后，缺少合适的tRNA会限制翻译速度。事实上，外源基因对植物来说并不是最合适的翻译序列，研究证明修饰外源基因的编码区可以提高蛋白的表达含量。优化抗原密码子后，LTB在马铃薯块茎中的表达量提高了5～40倍。但是优化病毒来源的基因密码子，却没有取得预期效果，可能是由于病毒基因的表达对真核生物来说已经是最有效的了。

3．3融合蛋白

这种方法多用在植物病毒表达系统中，促进抗原的稳定表达。将抗原与油质蛋白融合，可以在油料作物油体中积累，通过蛋白水解酶的作用，抗原可以从融合蛋白中释放出来。

3．4叶绿体转化

叶绿体转化中由于基因的拷贝数高，蛋白的表达量比核转化要高的多。外源基因通过特异位点整合的方式进入叶绿体基因组中，尽管转录产物能达到较高水平，但到目前为止还没有报道发现叶绿体转化中的基因沉默现象。除此，叶绿体在细胞中可以为基因的表达提供一个相对独立的环境。但是叶绿体中蛋白不能进行翻译后修饰，只能表达不需糖基化的蛋白。在叶绿体中成功表达的蛋白有CTB、破伤风毒素的TetC片段保护性抗原。

4结论

自从首例PMV投入市场以来，兽用疫苗由于限制不是很严格得到了较快的发展。口服给药是转抗原基因植物疫苗最为经济和有效的免疫方式，为提高免疫效果，需要对口服剂量和口服策略进行优化。动物疾病防治中抗生素逐步被禁止，促进了转抗原基因植物疫苗的发展。植物瞬时表达系统在产量和生产周期方面可以与传统的生产方式相匹比。许多兽用口服疫苗是否具有商业价值还需要进一步的田间培育和口服免疫评估。许多抗原疫苗具有高度的寄主特异性，在其他寄主中没有活性，所以需要对疫苗的各项指标进行评价。用来开发抗原疫苗的转基因植物对人类健康和环境的影响与现已存在的经遗传修饰的植物没有很大的差别。现已建立了许多措施来评价转基因植物的安全性，其主要问题是如何使公众面对转基因植物存在外源基因进入人类食物链的问题。总之，转基因植物的受体无论是何种植物，转抗原基因植物疫苗一定会被逐步接受，并进行大规模生产。

倪娜娜1，祝建波1，陈创夫2

(1.石河子大学农业生物技术重点实验室，新疆石河子832003；

 2．新疆地方与民族高发病实验室，新疆石河子832003)

    畜牧与兽医2009.6